[Entomofungo-l] BDA, tempo de leitura e sugestões

Quinta Abril 9 17:17:09 BRT 2009

Prezados Colegas,
Fica até difícil responder diante de tantas boas argumentações e experiência 
de cada um. Não dá para reunir tudo num e-mail, mas acho que colocando 
idéias separadas de cada amadurecemos o protocolo que em alguma ocasião vai 
ter que ser escrito....
A princípio posso colocar algumas observações que fiz analisando a 
viabilidade de produtos formulados:
a) o Marcos tem razão quanto ao procedimento de análise de produtos em óleo, 
no tempo de leitura, na dispersão do produto na placa, etc. Também confirmo 
que o produto deve ser "prensado" no meio. Em bolhas grandes de óleo o fungo 
não germina. Esse problema aumenta se o produto (mesmo óleo emulsionável) 
for diluído em água. 0,1mL de uma suspensão de óleo emulsionável em água´, 
quando espalhado na placa forma um filme de água. As gotas pequenas de óleo 
vão se juntando até a água evaporar sobre o meio e formam as bolhas grandes 
onde os esporos não tem contato com o meio. Fiz durante anos um sistema 
simples que dava boa precisão (acho que o Daian pôde verificar isso e deve 
até ter melhorado o protocolo), colocando um volume bem menor (10-20 
microlitros com micropipetador) do produto oleoso puro e sem diluição alguma 
sobre o meio. A técnica está em espalhar muito bem essa gotícula com a 
Drigasky, tipo "massa de pizza bem fininha". As gotas de óleo ficam 
inclusive com formato não circular, diferente do típico bolhas de óleo na 
água que são redondas.
b) tentei também colocar lamínula para prensar as gotas após plaqueamento, 
mas não consegui. Para Metarhizium anisopliae e Beauveria os esporos não 
germinam debaixo da lamínula. Todos germinam fora da lamínula. Não sei mas 
parece que talvez a falta de ar inviabiliza ou inibe a germinação.
c) após a incubação é interessante colocar uma pequena gota de corante na 
placa e uma lamínula para a leitura. Evita o suor na objetiva, evita furar o 
meio de cultura para quem não está acostumado e os esporos ficam mais 
visível com o corante em qualquer microscópio simples.

Também concordo com o Ítalo e Marcos quanto a Precisão e Reproducibilidade 
do protocolo para avaliação de produtos comerciais. Mas entendo as 
colocações do Zé. Um protocolo simples mesmo que não perfeito 
cientificamente já é de grande valia para o mercado. Se o consumidor tiver 
uma informação macro em que os produtos possam ser classificados em faixas 
de qualidade já é uma grande coisa nesse nosso mercado cheio de problemas. 
Pequenas variações técnicas adicionadas ao que o Zé propôs é válido, mas 
temos que evitar que fique muito caro, demorado, apesar de cientificamente 
melhor. Se vc colocar claramente num laudo (que tem que ser facilmente 
entendido pelo agricultor, eu já vi técnico e agrônomo de empresas sair 
mostrando e achando bom um laudo do próprio produto com 1x10^4/g de UFC e no 
rótulo constar 1x10^9/g, muitos não entendem esses números) que o produto 
tem entre 75-100% de viabilidade = categoria produto bom, ou 20-40% = 
categoria ruim, ou 0% = categoria = péssimo, e assim por diante em faixas, 
acho é o que o agricultor e a ABCbio querem. Esse protocolo mais 
aperfeiçoado (que eu vou chamar de protocolo extra) podemos continuar 
trabalhando nele, até por interesse científico de padronização de análise. 
Também para "o consumidor que tiver interesse" (porque seria uma análise 
mais cara), ou seja opicional, o protocolo extra poderia retirar dúvidas ou 
conflitos.
É só uma idéia.
Abs
Rogério

----- Original Message ----- 
From: "Marcos Faria" <mrf39 em cornell.edu>
To: <entomofungo-l em rumba.ufla.br>
Cc: <dgpdoliv em esalq.usp.br>
Sent: Thursday, April 09, 2009 3:50 PM
Subject: [Entomofungo-l] BDA, tempo de leitura e sugestões

Olá pessoal,

O meio BDA é uma ótima opção e vem sendo empregado desde, pelo menos, o
início do século passado. Em um desses memoráveis artigos de antigamente,
esculpido pelo Rorer em 1910, o Metarhizium inicialmente era cultivado
em... BDA e, em seguida, inoculado em ... bandejas metálicas contendo ...
grãos de arroz para produção de grandes quantidades do fungo para aplicação
em... canaviais, visando ao controle de .... cigarrinhas. Ele chegou a
fazer vários testes de campo através do polvilhamento do fungo em áreas
comerciais. Desculpem-me pelo rodeio, mas não pude resistir a trazer um
pedacinho de história. O resto todo mundo já sabe, pois este trabalho
repleto de criatividade influenciou bastante as pesquisas iniciadas no
Brasil no final da década de 60.

Quanto ao tempo de leitura, conforme foi conversado anteriormente, o
período proposto (16 a 18 h) pode funcionar bem para Beauveria, mas não é o
melhor para o Metarhizium. Para avaliações em laboratório de conídios
hidratados (após produção em placas de Petri etc...), pode ser que este
tempo dê uma boa indicação do potencial máximo de germinação. Mas para
produtos comerciais, muitos dos quais baseados em conídios bastante
desidratados, o emprego deste tempo estaria subestimando a viabilidade
potencial. Concordo 100% com o Ítalo de que Precisão e Reproducibilidade
são critérios que não podem faltar a um protocolo para avaliação de
produtos comerciais, mesmo que aumente um pouquinho, e é bem pouquinho
mesmo, o trabalho. O custo é praticamente o mesmo porque a quantidade do
fungicida a ser acrescida ao BDA é mínima. A propósito, estas análises
serão gratuitas ou pagas?

Sobre a avaliação da viabilidade em meio líquido, transcrevo abaixo (em
vermelho) as sugestões que havia encaminhado na semana passada para análise
da viabilidade de conídios em óleo. Mais uma vez, peço desculpas pelo longo
e-mail. Das próximas vezes tentarei ser mais breve (promessa difícil de
cumprir!).

a. Utiliza-se a primeira diluição da suspensão original usada para análise
de concentração. Pipeta-se 0,1 mL desta solução em 1uma placa de Petri com
meio Batata-Dextrose-Agar.
No caso de produtos à base de óleo, alguns passos têm que ser seguidos,
conforme detalhado em uma publicação nossa (Anais da Sociedade Entomológica
do Brasil 26(3): 569-572, 1997). Por exemplo, a alíquota de 0.1mL não pode
simplesmente ser adicionada ao meio de cultura e a viabilidade realizada
depois de 36 horas. Neste caso a viabilidade será provavelmente 0%. O
contato entre os conídios hidrofóbicos e o meio de cultura hidrofílico tem
que ser forçado, razão pela qual neste trabalho com M. anisopliae var.
acridum a gota de óleo contendo os conídios foi pressionada com uma
lamínula de vidro. Entretanto, recentemente tentei usar esta metodologia
com M. anisopliae e os resultados não foram bons, já que os óleos eram
diferentes. A alternativa que encontrei foi adicionar uma alíquota da
suspensão oleosa a um óleo mineral de baixa viscosidade. Mesmo sem o uso da
lamínula, os conídios "caem"para o fundo da gota de óleo e entram em
contato com o meio de cultura. A viabilidade pode ser facilmente
determinada em alguns campos, de preferência quando os tubos germinativos
ainda não estão muito grandes. Se isto for feito com um óleo de elevada
densidade, não ocorre o depósito dos conídios e a viabilidade será muito
baixa (às vezes 0%).

b. Acondiciona-se à temperatura de 25±2C por 36 horas.

c. Faz-se a leitura em microscópio óptico com aumento de 40 vezes. (400)

d. Dividi-se a placa de Petri em quatro campos e conta-se o número de
conídios germinados e não germinados, retirando-se a média e
determinando-se a porcentagem de germinados.
Este método de dividir a placa de Petri em quadrantes não se aplica para
produtos oleosos, pois neste caso se terá apenas "gotas com conídios", e a
análise é realizada apenas nas gotas.

e. Este procedimento será realizado 3 vezes com amostras independentes.

A avaliação da viabilidade de produtos oleosos pode ser bastante complexa.
Quando se trata de um produto formulado em óleo puro (não-emulsionável) ou
mesmo óleo emulsionável, o procedimento é simples (ver acima). Quando se
trata de produto em óleo emulsionável após mistura com água, a coisa muda
de figura, pois as gotículas de água no campo de observação podem ser
facilmente confundidos com conídios, sobretudo de B. bassiana. Quando se
trata de M. anisopliae, a confusão com gotículas de água é menos provável
de ocorrer, mas mesmo assim já tive muita dor de cabeça utilizando óleos
vegetais em função dos "debris" (gotículas de água, inclusive com formatos
diferentes, formados em função da presença do agente emulsificante) e,
consequentemente, tive dificuldades para visualizar ou diferenciar conídios
germinados dos não-germinados. Estou testando algumas alternativas aos
óleos vegetais quando se tem água na mistura e, em breve, espero poder
enviar sugestões para aperfeiçoamento da contagem de dispersões oleosas
(mistura de conídios com óleos emulsionáveis) após a mistura com água. Para
vcs do Instituto Biológico isto não é muito relevante porque a viabilidade
de produtos desta natureza será determinada sem a necessidade de mistura à
água. Mas no meu caso, que venho estudando alguns processos relacionados à
germinação após o contato com a água, o desenvolvimento de uma metodologia
mais precisa ainda é necessária.BD

Outras sugestões que eu havia apresentado anteriormente :

1) A adição de esferas de vidro no tubo de ensaio pode ser importante na
homogeneização da suspensão, pois quebra eventuais cadeias ou aglomerados
de conídios e ajuda a separar os conídios do substrato.

2) O número mínimo de conídios a ser contado é 300, sendo considerados
germinados aqueles que tiverem um tubo germinativo visível (alguns autores
preferem considerar germinados apenas os que têm tubo germinativo igual ao
diâmetro do conídio, mas eu particularmente adoto a forma anterior pois
acredito que a formação de uma protuberância já é indicação de que o esporo
está vivo). Este procedimento será realizado 3 vezes com amostras
independentes.

3) Definir melhor o que seria amostra independente, embora o uso de pelo
menos 3 embalagens diferentes do produto comercial me parece o mais 
indicado.

4) As análises serão expressas na forma de conídios viáveis por Kg ou Litro
do produto comercial.

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