[Entomofungo-l] BDA, tempo de leitura e sugestões

[Marcos Faria]

Olá pessoal,

O meio BDA é uma ótima opção e vem sendo empregado desde, pelo menos, o 
início do século passado. Em um desses memoráveis artigos de antigamente, 
esculpido pelo Rorer em 1910, o Metarhizium inicialmente era cultivado 
em... BDA e, em seguida, inoculado em ... bandejas metálicas contendo ... 
grãos de arroz para produção de grandes quantidades do fungo para aplicação 
em... canaviais, visando ao controle de .... cigarrinhas. Ele chegou a 
fazer vários testes de campo através do polvilhamento do fungo em áreas 
comerciais. Desculpem-me pelo rodeio, mas não pude resistir a trazer um 
pedacinho de história. O resto todo mundo já sabe, pois este trabalho 
repleto de criatividade influenciou bastante as pesquisas iniciadas no 
Brasil no final da década de 60.

Quanto ao tempo de leitura, conforme foi conversado anteriormente, o 
período proposto (16 a 18 h) pode funcionar bem para Beauveria, mas não é o 
melhor para o Metarhizium. Para avaliações em laboratório de conídios 
hidratados (após produção em placas de Petri etc...), pode ser que este 
tempo dê uma boa indicação do potencial máximo de germinação. Mas para 
produtos comerciais, muitos dos quais baseados em conídios bastante 
desidratados, o emprego deste tempo estaria subestimando a viabilidade 
potencial. Concordo 100% com o Ítalo de que Precisão e Reproducibilidade 
são critérios que não podem faltar a um protocolo para avaliação de 
produtos comerciais, mesmo que aumente um pouquinho, e é bem pouquinho 
mesmo, o trabalho. O custo é praticamente o mesmo porque a quantidade do 
fungicida a ser acrescida ao BDA é mínima. A propósito, estas análises 
serão gratuitas ou pagas?

Sobre a avaliação da viabilidade em meio líquido, transcrevo abaixo (em 
vermelho) as sugestões que havia encaminhado na semana passada para análise 
da viabilidade de conídios em óleo. Mais uma vez, peço desculpas pelo longo 
e-mail. Das próximas vezes tentarei ser mais breve (promessa difícil de 
cumprir!).

a. Utiliza-se a primeira diluição da suspensão original usada para análise 
de concentração. Pipeta-se 0,1 mL desta solução em 1uma placa de Petri com 
meio Batata-Dextrose-Agar.
No caso de produtos à base de óleo, alguns passos têm que ser seguidos, 
conforme detalhado em uma publicação nossa (Anais da Sociedade Entomológica 
do Brasil 26(3): 569-572, 1997). Por exemplo, a alíquota de 0.1mL não pode 
simplesmente ser adicionada ao meio de cultura e a viabilidade realizada 
depois de 36 horas. Neste caso a viabilidade será provavelmente 0%. O 
contato entre os conídios hidrofóbicos e o meio de cultura hidrofílico tem 
que ser forçado, razão pela qual neste trabalho com M. anisopliae var. 
acridum a gota de óleo contendo os conídios foi pressionada com uma 
lamínula de vidro. Entretanto, recentemente tentei usar esta metodologia 
com M. anisopliae e os resultados não foram bons, já que os óleos eram 
diferentes. A alternativa que encontrei foi adicionar uma alíquota da 
suspensão oleosa a um óleo mineral de baixa viscosidade. Mesmo sem o uso da 
lamínula, os conídios "caem"para o fundo da gota de óleo e entram em 
contato com o meio de cultura. A viabilidade pode ser facilmente 
determinada em alguns campos, de preferência quando os tubos germinativos 
ainda não estão muito grandes. Se isto for feito com um óleo de elevada 
densidade, não ocorre o depósito dos conídios e a viabilidade será muito 
baixa (às vezes 0%).

b. Acondiciona-se à temperatura de 25±2C por 36 horas.

c. Faz-se a leitura em microscópio óptico com aumento de 40 vezes. (400)

d. Dividi-se a placa de Petri em quatro campos e conta-se o número de 
conídios germinados e não germinados, retirando-se a média e 
determinando-se a porcentagem de germinados.
Este método de dividir a placa de Petri em quadrantes não se aplica para 
produtos oleosos, pois neste caso se terá apenas "gotas com conídios", e a 
análise é realizada apenas nas gotas.

e. Este procedimento será realizado 3 vezes com amostras independentes.


A avaliação da viabilidade de produtos oleosos pode ser bastante complexa. 
Quando se trata de um produto formulado em óleo puro (não-emulsionável) ou 
mesmo óleo emulsionável, o procedimento é simples (ver acima). Quando se 
trata de produto em óleo emulsionável após mistura com água, a coisa muda 
de figura, pois as gotículas de água no campo de observação podem ser 
facilmente confundidos com conídios, sobretudo de B. bassiana. Quando se 
trata de M. anisopliae, a confusão com gotículas de água é menos provável 
de ocorrer, mas mesmo assim já tive muita dor de cabeça utilizando óleos 
vegetais em função dos "debris" (gotículas de água, inclusive com formatos 
diferentes, formados em função da presença do agente emulsificante) e, 
consequentemente, tive dificuldades para visualizar ou diferenciar conídios 
germinados dos não-germinados. Estou testando algumas alternativas aos 
óleos vegetais quando se tem água na mistura e, em breve, espero poder 
enviar sugestões para aperfeiçoamento da contagem de dispersões oleosas 
(mistura de conídios com óleos emulsionáveis) após a mistura com água. Para 
vcs do Instituto Biológico isto não é muito relevante porque a viabilidade 
de produtos desta natureza será determinada sem a necessidade de mistura à 
água. Mas no meu caso, que venho estudando alguns processos relacionados à 
germinação após o contato com a água, o desenvolvimento de uma metodologia 
mais precisa ainda é necessária.BD


Outras sugestões que eu havia apresentado anteriormente :

1) A adição de esferas de vidro no tubo de ensaio pode ser importante na 
homogeneização da suspensão, pois quebra eventuais cadeias ou aglomerados 
de conídios e ajuda a separar os conídios do substrato.

2) O número mínimo de conídios a ser contado é 300, sendo considerados 
germinados aqueles que tiverem um tubo germinativo visível (alguns autores 
preferem considerar germinados apenas os que têm tubo germinativo igual ao 
diâmetro do conídio, mas eu particularmente adoto a forma anterior pois 
acredito que a formação de uma protuberância já é indicação de que o esporo 
está vivo). Este procedimento será realizado 3 vezes com amostras 
independentes.

3) Definir melhor o que seria amostra independente, embora o uso de pelo 
menos 3 embalagens diferentes do produto comercial me parece o mais indicado.

4) As análises serão expressas na forma de conídios viáveis por Kg ou Litro 
do produto comercial.